Métodos Alternativos de Análise Bacteriológica de Água

O grupo coliforme é composto por bactérias não só do intestino de mamíferos, como é o caso da Escherichia coli, mas também de outras de origem ambiental, sendo Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter. Os coliformes são utilizados como indicadores da qualidade de água.

Como já vimos aqui no bioneogenios, a técnica mais utilizada para análise bacteriológica da água é de tubos múltiplos. Entretanto, por falta de tempo, espaço ou algum outro fator, alguns laboratórios preferem adotar sistemas mais rápidos e práticos, chamados métodos alternativos, conforme veremos a seguir.

Presença e Ausência (P.A)                                                                                                                     

                                                                                

É bem semelhante à técnica dos tubos múltiplos, sendo muito usada por órgãos de fiscalização, como a Vigilância Sanitária. É um método qualitativo – apenas diz se há ou não a presença de coliformes na água.

Vantagens: baixo custo; precisa de pouco meio de cultura (em relação à técnica de tubos múltiplos); simples; suja pouca vidraria; é rápido e apresenta o resultado em 24h.

Desvantagens: não consegue distinguir os termotolerantes; utiliza toda a amostra, eliminando a possibilidade de repetir a análise; não quantitativo; alta probabilidade de falsos negativos.

Técnica: Aqui utilizamos o caldo lactosado em concentração tripla, uma vez que vai adicionar ao meio os 100 ml da amostra. O diferencial é que não é feito em tubo de ensaio com tubos de Durham mas em um erlenmeyer contendo um tubo de ensaio invertido, para captar o gás produzido. Adiciona-se um indicador chamado púrpura de bromocresol, que identifica o pH produzido pelos ácidos resultantes do metabolismo das bactérias. Quando acidifica o ambiente o indicador muda para amarelo. Aí está a importância do tubo invertido: algumas bactérias (sem ser do grupo coliforme) produzem ácidos em suas fermentações, o que causaria um falso positivo – como se sabe, uma das características de identificação do grupo coliforme é a produção de gases resultante da fermentação de glicose e lactose, sendo estes gases aprisionados no tubo invertido.

Logo, se o meio estiver amarelo, sem que haja presença de gás o resultado é negativo.

A positividade já reprova a água. Entretanto, alguns laboratórios levam uma alçada do resultado positivo para o caldo verde brilhante bile de boi 2% para verificar a presença ou não de bactérias coliformes termotolerantes.

Só pra vocês verem como fica :)

Membrana filtrante                                                                                                                                  

Vantagens: método específico; gasta pouco meio de cultura (1 placa); resultado rápido (24h); quali-quantitativo. 

Desvantagens: é uma técnica cara; necessita de aparelhos que não são da rotina, como a bomba a vácuo; não serve para águas turvas, pois a membrana iria “entupir” devido as partículas presentes no solvente; gasta toda a amostra; não diferencia o total de termotolerantes; não detecta a produção de gás.

Técnica: realiza a filtração a vácuo com uma membrana de porosidade 0,45 µm, sem permitir a passagem de bactérias. Em seguida a membrana é transferida para meios diferencial, seletivo e nutritivo (M-ágar LES ou ágar M-endo).

Meio M-endo: coliformes totais ficam rosa a vermelho, com brilho metálico. Incubação a 35°C por 24h.

Para colônias típicas e atípicas (não coliforme) é permitida a formação de até 200 UFC/100 ml.

Se for uma água com suspeita de ser pobre é permitido o uso de meios de enriquecimento menos seletivos, como o lauril triptose.

Substrato definido (Cromogênico e fluorogênico)                                                                                   

A obtenção do resultado depende da presença de enzimas produzidas pelas bactérias.

CROMOGÊNICO: cor.

FLUOROGÊNICO: fluorescência.

·         β-galactosidase: lactose → Glicose + galactose.

                                               ONPG (substrato) → nitrofenol.

É o nitrofenol que vai dar a cor amarela indicativa de coliformes totais.

·         βD-glucuronidase: MUG → 4-metilumbelifenona

A 4-metilumbelifenona é produzida pela Escherichia coli que, quando exposto à UV (366 nm) apresenta fluorescência esverdeada e brilhante. Algumas cepas de Klebsiella também fazem isso.

Técnica: Colocar os 100 ml da amostra em um erlenmeyer estéril e adicionar um sachê do substrato. A positividade é indicada pela coloração amarela ou fluorescência esverdeada. Incubar por 24h em estufa a 35°C.

Vantagens: consegue detectar termotolerantes e totais, ou seja, é específico; fácil; rápido.

Desvantagens: custo elevado; não quantitativo; gasta os 100 ml de amostra.