Técnica dos Tubos Múltiplos

A técnica dos tubos múltiplos é um método probabilístico. A partir dela é possível determinar o Número Mais Provável de bactérias do grupo coliforme em 100 ml de água (NMP/100 ml).

O NMP visa estimar a densidade de microrganismos presente na amostra de água ou alimentos baseado na frequência de resultados positivos.

Costumam ser aplicados para a pesquisa de coliformes em água e alimentos. Assim, podemos obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes totais (teste confirmatório) e sobre a população de coliformes termotolerantes/de origem fecal. A técnica dos tubos múltiplos e a determinação do NMP são baseados no Standard Methods for the Examination of water and Wastewater-APHA/American Public Health Association (1992), conhecida popularmente como a "Bíblia da Água".

Antes de nos aprofundarmos é necessário conhecer alguns termos:

• Enterobactérias - bacilos Gram-negativos isolados no trato gastrointestinal de humanos e animais, solo, águas e plantas. São oxidase negativa, não esporuladas e reduzem nitrato a nitrito.  Fermentam lactose e produzem gás.
• Coliformes totais - indicadores de contaminação pertencentes a família Enterobacteriaceae. Os gêneros são: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. Estas últimas são normalmente de origem ambiental.
• Coliformes termotolerantes ou fecais - indicadores de contaminação fecal. Toleram altas temperaturas (até 44,5°C). 

Material                                                                                                                                                                               

• Meios de cultura - para o cultivo artificial dos microrganismos. 
• Para a primeira fase (presuntiva) utilizamos o caldo lactosado, que é um meio de enriquecimento. O caldo lactosado, como seu próprio nome diz, oferece lactose à bactéria. Como sabemos, os coliformes pertencem às enterobactérias, microrganismos fermentadores de lactose.



Caldo lactosado com tubo de Durham captando gás proveniente da fermentação.



• Na etapa confirmatória o meio utilizado é o caldo lactosado verde brilhante bile de boi 2%. O objetivo deste caldo é mimetizar as condições intestinais, fornecendo determinada concentração de sais biliares. Estes sais provocam certa pressão osmótica, "matando" qualquer bactéria que não esteja habilitada a viver no intestino - em outras palavras, somente os coliformes totais sobrevivem.

Caldo verde brilhante. O último tubo está positivo (aprisionamento de gás).

• Para a pesquisa de termotolerantes é necessário o caldo EC, que também é um meio seletivo, somente permitindo o crescimento das bactérias de origem fecal que sobrevivem a 44,5°C.

• Equipamentos e vidrarias 
• Estufa bacteriológica - crescimento a 35-37°C.
• Banho maria - crescimento de termotolerantes a 44,5°C
• Alça bacteriológica de platina ou níquel cromo - para transferir alçadas de um tubo a outro.
• Tubos de ensaio 
• Tubos de Durham - observar a presença/captação de gás.
• Pipetas estéreis.
• Bico de bunsen.

Metodologia                                                                                                                                                                                                 

Após tamponar, esterilizar os tubos já com o tubinho de Durham em estufa a 180°C durante 2h. Após isso, preparar os meios, distribuir (10 ml em cada) e autoclavar. Cuidado para não formar bolhas durante a autoclavagem. Uma estratégia utilizada pelos laboratórios de análise de água é deixar a autoclave fechada durante horas, após o processo de esterilização, até que o aparelho tenha esfriado.

1. TESTE PRESUNTIVO

Aqui se detecta bactérias fermentadoras de lactose. 

O teste consiste na inoculação da amostra seriadamente nos tubos.

Para isso, cinco tubos vão conter caldo lactosado em concentração dupla (ou seja, o dobro de meio desidratado para a quantidade desejada de água) e dez tubos vão apresentar concentração simples.

Os tubos de concentração dupla vão receber 10 ml da amostra, que serão transferidas com a pipeta estéril.

Dos dez tubos de concentração simples vamos dividir assim:

Cinco receberão 1 ml de água. E os cinco restantes recebem 0,1 ml de água.

Tubos positivos, indicando presença de
fermentadores de lactose.

A positividade de teste é indicada pela captação de gás pelos tubos de Durham, que é produto do metabolismo bacteriano. É representada por uma bolha dentro do vidro, conforme indicado na figura acima. O tamanho da bolha varia de acordo com a produção de gás proveniente da fermentação da bactéria. Mesmo que seja observável a presença de gás em 24h de incubação, o ideal é realizar a leitura no período de 48h.
Os tubos que se apresentarem positivos em 48h devem ser separados para a etapa confirmatória. Os negativos podem ser descartados.

2. TESTE CONFIRMATÓRIO
Neste tipo de ensaio, como o próprio nome diz, vai se confirmar a presença de coliformes totais, que podem ser das espécies presentes nos animais Escherichia coli e algumas espécies Klebsiella sp., além de Citrobacter sp.e Enterobacter sp., que são bactérias ambientais.
Esta etapa é mais simples.
Após preparo do caldo lactosado verde brilhante bile de boi 2% (ou simplesmente "verde brilhante"), também com tubos de Durham, vai-se inocular 1 ou 2 alçadas dos tubos que foram positivo no teste presuntivo. Isto é, se dos 15 tubos da série presuntiva 6 derem positivos, os 6 devem ser passados para o verde brilhante para fazer a confirmação para o grupo coliforme.
Resumindo: todos os tubos positivos serão inoculados em caldo verde brilhante, com alça bacteriológica. Só são necessárias 1 ou 2 alçadas.
Novamente incuba em estufa a 37 °C durante 24-48h.
Assim como na etapa anterior, a positividade de teste é indicada pela captação de gás pelos tubos de Durham.

Caldo verde brilhante. O último tubo está positivo (aprisionamento de gás).
Presença de coliformes totais.

A detecção de coliformes totais já reprova uma água, segundo a Portaria 2914 de 2011.

3. DETERMINAÇÃO DE TERMOTOLERANTES
Também são chamados de coliformes fecais, por serem colonizadores do intestino de animais e do homem. Indicam contaminação recente por fezes.
O teste baseia-se na transferência de 1 ou 2 alçadas dos tubos positivos da etapa confirmatória (caldo verde brilhante) para o caldo EC.
O diferencial deste teste é a incubação. Em vez de ser na estufa, vai ser em banho maria, a 44,5°C, que é a temperatura que as espécies fecais E. coli e algumas cepas de Klebsiella sp. conseguem suportar - daí o nome "termotolerantes". 
Igualmente, a positividade é expressa na captação do gás pelos tubos de Durham.


Principais Referências:
Brasil. Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água. 2a ed. rev. - Brasília: Fundação Nacional de Saúde, 2006.