sábado, 27 de outubro de 2012

Identificação de cocos Gram-positivos

O gênero Staphylococcus é composto por 37 espécies, 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. Geralmente são encontrados na pele e mucosas.
Rotineiramente o teste de catalase é usado para diferenciar estafilo (catalase +) de estreptococos (catalase -), mas não significa que não exista nenhuma espécie de estafilococos que não possua a enzima catalase.

A seguir um esquema que identifica as principais espécies de Staphylococcus. Se tiver dificuldade de ver, clique na imagem.


Prova da catalase                                                                                                                  

Tem a finalidade de verificar a presença da enzima catalase, que decompõe H2O2 em água e oxigênio.
  • Colocar uma colônia numa lâmina de microscopia e dissolver peróxido de hidrogênio. 
  • Observar a presença (+: estafilococos) ou não (-: estreptococos) de bolhas.

Prova da coagulase                                                                                                                  


Existe o teste em tubo e em lâmina. Tem a finalidade de verificar se o microrganismo possui a coagulase (fator aglutinante).

TUBO
  • Colocar 0,5mL de plasma em tubo de ensaio
  • Adicionar uma colônia com alça bacteriológica diretamente no plasma de coelho com EDTA
  • Incubar por 4h em estufa a +/- 37ºC
  • Observar a formação de coágulo (brumos), característica de S. aureus.
LÂMINA
  • Colocar 2 gotas de salina na lâmina
  • Emulsionar a colônia
  • Adicionar 1 gota de plasma e misturar
  • Observar a formação de coágulo (brumos), característica de S. aureus.
A prova em tubo pesquisa coagulase livre e ligada que, reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina.
O teste em lâmina verifica a coagulase ligada na superfície da parede celular, que reagindo com o fibrinogênio do plasma, causa a coagulação do mesmo.




Teste de DNAse com HCl                                                                                                                

Tem o objetivo de verificar se a bactéria possui a enzima desoxirribonuclease.
  • Fazer inóculo denso e circular em uma região do meio.
  • Incubar por aproximadamente 24h a cerca de 37ºC.
  • Após incubação, realizar leitura com aplicação de HCl de modo que cubra as colônias. Aguardar 30s.
A formação de um halo transparente identifica S. aureus. Se não houver halo, identificar como estafilococo coagulase negativa.



Fermentação em manitol                                                                                                                  

Observar a capacidade do microrganismo em crescer num meio salino (7,5% de NaCl) e fermentar o manitol.
  • Semear no ágar manitol
Leitura: formação de halo amarelo ao redor das colônias, típico de S. aureus.

Teste de resistência à novobiocina                                                                                                  

Finalidade: Verificar se o germe é resistente ao antibiótico.
  • Semear por atapetamento (como para biograma) em ágar sangue
  • Colocar um disco de novobiocina
  • Incubar a 37ºC por aproximadamente 24h.
A formação de halo igual ou inferior a 16mm identifica Staphylococcus saprophyticus.


O S. pyogenes também pode ser identificado com teste de PYR



Como supracitado, a negatividade no teste da catalase indica Streptococcus. Todos os procedimentos de identificação deste gênero se baseia inicialmente no tipo de hemólise apresentada no ágar sangue de carneiro.

Teste de Camp                                                                                                                  

Visa a identificação de cepas de S. agalactiae, que produzem o fator CAMP.

  • Inocular uma estria de S. aureus de um ponto a outro na placa de ágar sangue.
  • Semear perpendicularmente a colônia a ser estudada, sem que haja o contato com a outra bactéria!
  • Levar à estufa.
A formação da seta hemolítica entre a colônia de aureus e o outro microrganismo indica positividade pra Streptotococcus agalactiae.



Teste de sensibilidade à bacitracina                                                                                             

Esse teste vai diferenciar S. pyogenes das outras espécies beta-hemolíticas. 
  • Semeio por atapetamento em sangue de carneiro
  • Aplicação do disco de bacitracina
  • Incubação
A presença de qualquer halo de inibição é interpretada como sensibilidade = S. pyogenes.

Teste de PYR                                                                                                                             

Determina a atividade de enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo S. pyogenes.
  • Com auxílio de pinça, colocar um disco de PYR sobre uma lâmina
  • Pingar uma gota de água estéril
  • Realizar um esfregaço com a bactéria sobre o disco úmido
  • Colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá em 1min.
O resultado positivo se apresenta na cor vermelha, enquanto a cor amarela/laranja significa negatividade.





Prova da Optoquina                                                                                                                  

A presença de halo maior ou igual a 14mm indica que a bactéria identificada se trata do Streptococcus pneumoniae.



Quando a bactéria apresenta γ-hemólise, segue-se a identificação da figura.


Bile esculina                                                                                                                                  

Esse teste serve para identificar o gênero Enterococcus sp. A bile esculina é um meio rico em sais biliares. Alguns microrganismos possuem a capacidade de hidrolisar a esculina em esculetina na presença de bile. O composto formado complexa-se com íons ferro presente no meio e forma um precipitado perto que indica a positividade do teste.

Teste de crescimento em NaCl 6,5%                                                                                           

Confirma o gênero Enterococcus sp. depois da bile. Os enterococos são capazes de crescer em meio hipertônico.

  • Inocular as colônias em caldo NaCl 6,5% e observar o crescimento após incubação.
A leitura positiva se dá por alteração da cor - de roxo para amarelo.



Baseado nos livros Bacteriologia Clínica: Manual de aulas práticas (2010) e Boas Práticas de Microbiologia Clínica (2008).


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