Um dos avanços fundamentais no desenvolvimento da clonagem molecular foi a descoberta (em meados da década de 70) das
endonucleases de restrição bacterianas. Essas proteínas são simplesmente chamadas de
enzimas de restrição. Estas
reconhecem sequências de DNA de fita dupla específicas (geralmente curtas, de 4 a 6 pares de bases nitrogenadas) e as
cortam no sítio de reconhecimento ou bem próximo a ele. São chamadas de
tesouras biológicas.
Enzima de Restrição ou endonuclease
de restrição é um tipo de nuclease que cliva a fita dupla de DNA sempre que
identificar as sequências específicas para as quais estão programadas.
A nomenclatura que essas enzimas recebem são
baseadas nos microrganismos de onde elas foram isoladas, como, por exemplo, a
EcoRI, isolada a partir da bactéria
Escherichia coli R, e a
BamHI, proveniente do
Bacillus amyloliquefasciens H. Relembrando: essas enzimas são altamente específicas: reconhece e corta apenas a sequência de nucleotídeos para a qual ela está programada.
Muitas enzimas de restrição (
EcoRI,
HindIII,
PstI...) produzem
cortes em ziguezague nos sítios de restrição das cadeias de DNA,
originando fragmentos que possuem uma “cauda” com uma só cadeia –“sticky” ends ou
extremidades coesivas. As “caudas”, de ambos os lados,
são complementares às de todos os outros fragmentos gerados pela mesma enzima de restrição (ou outra enzima de restrição que origine as mesmas extremidades coesivas). Assim, à temperatura adequada, estas regiões “single-stranded”
podem portanto emparelhar com as dos outros fragmentos de DNA gerados pela mesma enzima de restrição.Algumas enzimas de restrição, como a
AluI e
SmaI,
clivam ambas as cadeias de DNA no mesmo ponto do sítio de restrição, originando extremidades “blunt” (abruptas),
nas quais todos os nucleotídeos das extremidades do fragmento se encontram emparelhados.