Tecnologia do DNA Recombinante

Um dos avanços fundamentais no desenvolvimento da clonagem molecular foi a descoberta (em meados da década de 70) das endonucleases de restrição bacterianas. Essas proteínas são simplesmente chamadas de enzimas de restrição. Estas reconhecem sequências de DNA de fita dupla específicas (geralmente curtas, de 4 a 6 pares de bases nitrogenadas) e as cortam no sítio de reconhecimento ou bem próximo a ele. São chamadas de tesouras biológicas.

Enzima de Restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva a fita dupla de DNA sempre que identificar as sequências específicas para as quais estão programadas.

 A nomenclatura que essas enzimas recebem são baseadas nos microrganismos de onde elas foram isoladas, como, por exemplo, a EcoRI, isolada a partir da bactéria Escherichia coli R, e a BamHI, proveniente do Bacillus amyloliquefasciens H. Relembrando: essas enzimas são altamente específicas: reconhece e corta apenas a sequência de nucleotídeos para a qual ela está programada.
Muitas enzimas de restrição (EcoRI, HindIII, PstI...) produzem cortes em ziguezague nos sítios de restrição das cadeias de DNA, originando fragmentos que possuem uma “cauda” com uma só cadeia –“sticky” ends ou extremidades coesivas. As “caudas”, de ambos os lados, são complementares às de todos os outros fragmentos gerados pela mesma enzima de restrição (ou outra enzima de restrição que origine as mesmas extremidades coesivas). Assim, à temperatura adequada, estas regiões “single-stranded” podem portanto emparelhar com as dos outros fragmentos de DNA gerados pela mesma enzima de restrição.Algumas enzimas de restrição, como a AluI e SmaI, clivam ambas as cadeias de DNA no mesmo ponto do sítio de restrição, originando extremidades “blunt” (abruptas), nas quais todos os nucleotídeos das extremidades do fragmento se encontram emparelhados.

BREVE HISTÓRICO DA ENGENHARIA GENÉTICA

• Em 1944 Avery descobriu que o DNA era o principal componente cromossômico e que é ele quem transmite as informações genéticas.
• Em 1953 houve a descoberta da estrutura de dupla hélice do ácido desoxirribonucleico (Watson & Crick)
• Em 19767 identificou-se a DNA ligase.
• Em 1970 descobriram-se as enzimas de restrição.
• Em 1974 houve a quebra da barreira interespécies - um pesquisador "cruzou" o material genético de um animal com uma bactéria, produzindo o primeiro ser com DNA recombinante.
• Em 1976 foi desenvolvida a primeira proteína humana produzida por bactérias.
• 1982 começou a ser produzida insulina humana transgênica e o primeiro animal transgênico (camundongo)
• 1983 é criado o fumo transgênico (modificação de plantas).
• Em 1985 Mullis desenvolveu a primeira técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Em 2011 foi clonado o primeiro animal: Dolly.

DNA recombinante (rDNA) é uma seqüência de DNA artificial que resulta da combinação de diferentes sequências de DNAs de diferentes espécies (ex.: DNA de planta ligado a um plasmídio). Essa técnica surgiu a partir da evolução da engenharia genética.

VETORES

Vetor é uma molécula de DNA que se replica de forma independente num hospedeiro, com as bactérias ou as leveduras. Desse modo pode se obter inúmeras cópias por células. Abaixo os principais vetores utilizados.

• Plasmídios - DNA duplo, circular que se replicam extracromossomicamente em bactérias. São ideais para manter grande número de cópias, devido à sua facilidade de manipulação. Possuem um ou mais marcadores selecionáveis (em geral um gene que confere resistência a antibióticos) e um ou mais sítios de restrição para DNAs exógenos. A figura abaixo detalha o procedimento de clonagem por plasmídio.
• Bacteriófagos lambda - é um vírus bacteriano com uma molécula de DNA de duplo filamento (aproximadamente 45kb). Durante o crescimento em E. coli o lambda replica-se produzindo numerosos vírus infecciosos e destruindo as células bacterianas, liberando os bacteriófagos (+ 1 milhão). Adequado para clonagem de fragmentos razoavelmente grandes de DNA humano.
• Cosmídios - Fragmentos maiores de DNA estranho (até 50kb) podem ser clonados em cosmídios. Cosmídios são plasmídios que usam a capacidade infecciosa de bacteriófagos para armazenar os grandes fragmentos de DNA linear e introduzir em células bacterianas.
• Cromossomos artificiais de leveduras - Possuem capacidade de armazenamento de até 1000 kb.

PASSOS PARA A CLONAGEM

O primeiro passo é ter o DNA doador e o vetor desejado.
Em seguida é preciso cortar o DNA do doador e do vetor com uma enzima de restrição na sequência desejada. Depois fazer a ligação do vetor com o inserto, através de uma ligase.
Daí é só inserir no hospedeiro, observar as transformações, selecioná-las, isolá-las e preservá-las para as próximas utilizações.
Pode inserir vetores em bactérias por eletroporação, choque térmico, transdução (bacteriófagos) e tratamentos químicos.

Veja abaixo uma síntese da produção de um DNA recombinante.

Em células eucarióticas, os processos de inserção de vetores são biobalística, eletroporação, laser, microinjeção, infecção viral.

APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

• A produção da insulina, os interferonas, a interleucina.
• A produção de algumas proteínas do sangue: a albumina e o fator VIII. 
• A produção do hormônio do crescimento. 
• A produção de alguns tipos de ativadores das defesas orgânicas para o tratamento do câncer, como o fator de necrose tumoral. 
• A criação de vacinas sintéticas.
• Para a Clonagem. 
• Vida sintética. 
• Na transgênese, em que se introduz numa espécie uma parte do DNA de outra. 
• Teste de paternidade.
• Desenvolvimento de espécies animais mais "lucrativas" (bovinos com maior massa muscular, maior produção leiteira; plantas com maior resistência à pragas e à seca).